Терапия зла. Как технологии лечения митохондриальных болезней 24 года идут к легализации.
Torsten Wittmann, University of California, San Francisco / NIH / flickr CC BY-NC 2.0
Некоторые генетические болезни мы могли бы лечить еще 20 лет назад — методом пересадки митохондрий. Но реальные попытки его применить закончились обвинениями ученых в евгенике, скандалами и запретами, а митохондриальные болезни так и остались неизлечимыми. С тех пор биотехнология шагнула вперед, у нас появились системы редактирования генома и первые пациенты, чьи гены удалось переписать. Время совершить очередной подход к митохондриальным генам. Сможем ли мы на этот раз обойтись без скандалов?
Первые шаги
Когда в августе 1996 года врачи из клиники в Нью-Джерси ввели сперматозоиды мистера Отта в 14 яйцеклеток миссис Отт, никто еще не знал, какая из них превратится в маленькую Эмму и чем закончится эта история для пациентов с митохондриальными болезнями. Тогда супружеская пара Оттов готова была на любые риски после 6,5 лет тщетных попыток зачать ребенка, а доктор Жак Коэн надеялся на успех своей новой методики. Суть ее была проста: в процессе искусственного оплодотворения в яйцеклетку матери врачи ввели не только сперматозоид отца, но и десятую часть цитоплазмы из яйцеклетки молодой женщины-донора.
Из 14 яйцеклеток, оплодотворенных таким образом, шесть начали развиваться нормально, четыре подсадили в организм матери, одна прижилась, выросла в Эмму Отт и родилась в срок без осложнений. Коэн с коллегами отчитались в журнале The Lancet о том, что им успешно удалось восстановить фертильность 39-летней женщины, предыдущие зародыши которой развивались неправильно. Нью-Йоркские газеты вовсю рекламировали их успехи. Десятки бесплодных супружеских пар обращались в клинику за помощью, и за следующие четыре года на свет появились еще 16 подтверждений того, что методика работает.
А потом грянул гром.
Коэн и коллеги продолжали совершенствовать свою методику и следить за результатами. В 2000 году они обнаружили, что в разных зародышевых тканях и клетках новорожденных, которые появились на свет в результате пересадки цитоплазмы, остались следы донорских генов.
Эмбрионы на третий день после оплодотворения. (a) яйцеклетка матери + сперматозоид отца; (b) яйцеклетка матери + сперматозоид донора; (c) яйцеклетка донора + сперматозоид отца, (d) яйцеклетка матери + сперматозоид отца и инъекция ооплазмы донора
Carol Brenner et al. / Fertility and Sterility, 2000
Возможно, это наблюдение и прошло бы незаметно, если бы в 2001 году они не опубликовали еще один короткий отчет, посвященный долгосрочным наблюдениям за детьми. На этот раз они нашли следы донорских генов в крови и слизистой щеки у двух годовалых младенцев и честно объявили: «это первый случай наследуемой генетической модификации» — чем и загубили все дело.
Фраза продолжалась словами «... которая привела к рождению нормальных здоровых детей», но это уже никого не волновало.
СМИ бросились обсуждать «первых в мире ГМ-детей» и говорить о возвращении евгеники. FDA, американский аналог Росздравнадзора, потребовало от репродуктивных клиник считать использование донорских яйцеклеток экспериментальной процедурой и получать на них специальное разрешение. Возведя «бумажную стену», бюрократия обуздала технологию и фактически похоронила спорный метод.
Чужой внутри
Сам же Коэн не ставил своей целью создание генетически модифицированных людей и даже не признавал свой метод модификацией — все гены ребенка остались на месте и никак не изменились. Он просто считал, что причина бесплодия кроется в постаревших яйцеклетках женщин и искал способ их омолодить. Более того, врачи из его команды специально следили, чтобы в микрокапилляр (с помощью которого в яйцеклетку вводили сперматозоид и донорскую цитоплазму) не попали чужие хромосомы — от донора им нужна была только цитоплазма, и ее забирали с той стороны яйцеклетки, где не было генетического материала. С этой частью процедуры они справились успешно: в крови детей никаких чужеродных ядерных генов впоследствии не обнаружили.
Инъекция сперматозоида в яйцеклетку
СС0
Однако вместе с донорской цитоплазмой в зародыш могли попасть и другие части яйцеклетки, в том числе, митохондрии. Сами по себе они могут быть даже полезны: добавочные митохондрии могут снабдить развивающуюся яйцеклетку дополнительной энергией.
У митохондрий внутри есть собственный геном. Именно его и нашел Коэн в клетках детей, что побудило его использовать столь напугавшее приличную общественность словосочетание «генетическая модификация».
Гетероплазмия — соседство нескольких типов митохондрий в одной клетке — сама по себе не влияет на внутриклеточную жизнь. Более того, она естественным образом появляется в стареющих клетках человека, по мере того как митохондрии накапливают мутации. Поэтому нет никаких причин думать, что чужая митохондриальная ДНК могла повлиять на судьбу и развитие детей. В 2016 году Коэн и коллеги отчитались о здоровье уже выросших «экспериментов»: никаких серьезных аномалий развития, никаких тяжелых болезней, хорошие оценки в школе.
(a) Яйцеклетки через 10 минут после инъекции донорской ооплазмы (красная) (b) Трипронуклеарные зиготы через 24 часа после инъекции донорской ооплазмы. По мнению ученых, красные точки это именно митохондрии
Jason A. Barritt et al. / Human Reproduction, 2001
Но научное сообщество волновало не только здоровье детей. Гораздо более важным аргументом стал тот факт, что часть этих детей — в том числе и «первенец» Коэна Эмма Отт — девочки, а значит, могут передать свой необычный митохондриальный состав по наследству, положив начало клану «неестественно» гетероплазмичных людей.
С тех пор появились свидетельства того, что гетероплазмия в клеточных культурах бывает обратимой, и пришлые митохондрии на чужбине постепенно вымирают. Но многие участники исследований Коэна отказались проверять кровь своих взрослых детей на гетероплазмию, и мы едва ли теперь узнаем, насколько состоятельны были опасения FDA. Запрет регулятора остается в силе по сей день, и ученым пришлось искать обходные пути к лечению бесплодия.
Вторая мать
Коэн так и не смог сказать наверняка, какая именно часть донорской цитоплазмы если не омолодила яйцеклетки, то хотя бы помогла женщинам забеременеть. Это могли быть не только органеллы, но и какие-нибудь отдельные молекулы из молодой цитоплазмы, например, белки или информационные РНК. Тем не менее, работа ученого создала важный прецедент: для создания ребенка можно использовать донорский материал третьего человека. И как только его эксперименты заглохли под пристальным взглядом FDA, дальнейший прогресс переехал в Китай.
Вскоре после того, как FDA изменили правила игры, конкуренты Коэна перенесли свои эксперименты из Нью-Йорка в Гуанчжоу, где никаких запретов еще не существовало. Там молодому эмбриологу Джону Чжану пришло в голову сделать все наоборот: если можно пересадить участок цитоплазмы из молодой яйцеклетки в старую, то почему бы не попробовать сделать наоборот — пересадить ядро старой яйцеклетки в молодую? Технологию переноса ядер (позже ее назвали переносом пронуклеусов) он опробовал в 2003-м: оплодотворил старую (материнскую) и молодую (донорскую) яйцеклетки, затем из второй удалил ядро и пересадил туда ядро первой.
(a) Перенос веретена (мексиканский эксперимент Чжана) (b) Перенос пронуклеусов (китайский эксперимент Чжана))
Steve Connor / Nature, 2017
Насколько эксперимент оказался успешным, сказать сложно. В культуре начали развиваться сразу пять эмбрионов, которые и перенесли пациентке. Из них прижились сразу три. Ученые решили, что это опасно, и вызвали аборт одного из зародышей, а остальные два позже погибли сами. Поэтому Чжан, в отличие от Коэна, не смог доказать, что его методика безопасна. Эксперименты снова запретили — на этот раз уже китайские регуляторные органы, мотивируя это подозрительной близостью исследований к попыткам клонировать человека (а вот оно в Китае запрещено).
Но история, естественно, на этом не закончилась: эту спорную терапию бесплодия (перенос пронуклеусов) продолжают использовать и сейчас. В 2016 году ее начали применять в Украине, в 2019 первый такой ребенок появился в Греции.
Смена курса
Те же, кто не верил в то, что митохондрии могут «омолодить» яйцеклетку, наметили еще один потенциальный выхлоп из этого метода. Перенос пронуклеусов мог бы стать избавлением от мутаций в митохондриальных генах. Довольно часто такие мутации делают своих носителей инвалидами в раннем возрасте: поскольку митохондрии поставляют в клетки энергию, страдают чаще всего главные ее потребители — мышцы и нервы. Носительница таких мутаций не может зачать здоровых детей естественным путем, так как с митохондриями отец помочь никак не может: их ребенок наследует строго от матери.
Таким образом, перенос пронуклеусов можно было использовать как терапию митохондриальных болезней. На это обратили внимание сразу несколько исследовательских групп. Американский биолог русского происхождения Шухрат Миталипов, известный как пионер редактирования генома человека, еще в 2013 году основал компанию Mitogenome therapeutics и начал проверять методику на макаках. Профессор Мэри Герберт из британского Ньюкасла добилась разрешения провести первую такую процедуру в 2017 году. Но Джон Чжан, потерпев фиаско в Китае с починкой бесплодия, все-таки успел быстрее всех.
Джон Чжан с первым ребенком от трех родителей
New Hope Fertility Center
Первый «его» ребенок появился на свет в Мексике в 2016 году, где власти регулированием деторождения не столь озабочены. Родители мальчика были мусульманами, и классический метод переноса пронуклеусов для них был невозможен — для этого пришлось бы разрушить оплодотворенную яйцеклетку донора, то есть убить зародыш, что религиозные нормы родителей не позволяли. Поэтому Чжан использовал альтернативный метод — перенос веретена, то есть сначала пересадил генетический материал матери в донорскую яйцеклетку (без ядра), а затем устроил ей «свидание» со сперматозоидом отца. Но и такой трюк не пришелся мировой общественности по вкусу. Родившегося мальчика окрестили «ребенком от трех родителей», и начался новый скандал.
Двери закрываются
Одни ученые обвинили Чжана в экспериментах на живых людях, другие предложили проводить подобные испытания только на эмбрионах мужского пола, которые заведомо не передадут «результат» эксперимента потомству. Третьи задались вопросом: есть ли у Чжана доказательства того, что у ребенка не возникнет гетероплазмии или даже отката к изначальному состоянию? Доказательств у Чжана не было: родители забрали ребенка и отказались от долгосрочного наблюдения.
Итог скандала был предсказуем: FDA укрепило возведенную прежде «бумажную стену» и запретило любые манипуляции по замещению митохондрий. Великобритания осталась единственной страной, где они сейчас официально одобрены — в редких случаях и после долгих обсуждений наверху, в кабинетах Управления по оплодотворению человека и эмбриологии. Всем остальным желающим экспериментировать с яйцеклетками и их митохондриями приходится искать себе страну, где законодательство никак эту методику не регулирует, и не слишком сильно афишировать свои исследования.
Митохондриальные болезни могли бы стать первыми генетическими болезнями, которые люди научились лечить массово — но не стали. К методике митохондриального переноса прочно приклеилось название «ребенок от трех родителей», и несмотря на то, что сами исследователи считают его некорректным — донорских генов всего 37, а от отца и матери их по 20 тысяч — оно теперь устойчиво ассоциируется с нарушением этических норм. Поэтому, чтобы решить проблему бесплодия или избавить своего ребенка от риска стать обладателем целого букета неизлечимых болезней, родителям приходится отправляться в «эмбриологические турне», иногда на другой край света.
ЭМ-снимок митохондрии. Черные точки близко к поверхности мембраны — это мтДНК, помеченная частицами золота
Francisco J Iborra et al. / BMC Biology, 2004 / CC BY 2.0
А потом появился способ вылечить генетические болезни, скрытые уже не в органеллах клетки, а прямо в ее ядре. Несмотря на то, что люди, которые первыми придумали применять CRISPR/Cas9 к человеческим генам, заранее предупреждали, что система к этому еще не готова, история повторилась. Воспользовавшись тем, что китайское законодательство закрыло калитку для манипуляций митохондриями, но ничего не сказало о редактировании генов, очередной первопроходец Цзянькуй Хэ опробовал CRISPR на эмбрионах. Дальше случилось то же, что и всегда: скандал, запреты, попытки не допустить повторения ситуации с «детьми от трех родителей» (впрочем, ВОЗ вот уже год с небольшим работает над стандартами надзора за манипуляциями с человеческим геномом, и упорно избегает слова «мораторий»; тем временем во многих странах официального запрета на CRISPR-детей нет до сих пор).
Но поскольку лечить генетические болезни все-таки нужно, появился компромиссный вариант — CRISPR-терапия. Иными словами, пока мир разбирается с тем, имеем ли мы право редактировать эмбрионов, можно тренироваться на взрослых: вводить им в кровь систему редактирования и чинить поломки прямо в работающих тканях. Этот метод уже отработали на самых разных клетках, и недавно перешли к испытаниям in vivo.
По мере того, как CRISPR отвоевывал себе одну терапевтическую область за другой, стало понятно, что против митохондриальных мутаций он бессилен. Дело в том, что большинство систем генетического редактирования работают, как ножницы, разрезая ДНК в условленном месте. И если ядерную ДНК после такого клетка легко восстанавливает, соединяя концы разрыва, то митохондриальную разрушает — в норме она свернута в кольцо, так что двунитевой разрыв считается не рядовой поломкой, а признаком серьезной проблемы. Поэтому потери от такого редактирования могут превысить выигрыш.
Так митохондриальные болезни не только не стали первым достижением генетической терапии, но и вовсе остались последним не взятым бастионом.
Параллельные дороги
Справедливости ради стоит сказать, что модификация эмбрионов — не единственный способ справиться с митохондриальными дефектами. Например, митохондрии можно пересаживать не в яйцеклетку, а в уже родившийся организм (подобно тому как сейчас вводят CRISPR/Cas).
Сейчас клинические испытания проходят две терапии такого рода. В рамках первой — наращивания митохондрий (mitochondrial augmentation therapy) — ребенок получает донорские митохондрии от матери (в случае, если его митохондриальная болезнь возникла с нуля, а не досталась от матери). У ребенка забирают клетки — например, стволовые клетки крови — и культивируют их вместе с митохондриями, выделенными из клеток матери. Считается, что при этом клетки крови ребенка поглощают материнские органеллы, становятся более жизнеспособными и будут активно размножаться после возвращения в организм, таким образом поддерживая работу «сломанных».
Вторая терапия предполагает, что ребенок становится донором митохондрий сам для себя — например, в случае ишемии сердца при родах или в первые часы жизни. Тогда из какой-нибудь скелетной мышцы вырезают кусочек ткани, выделяют оттуда митохондрии и вводят их в сердечную мышцу. Этот метод недавно опробовали на пяти новорожденных: двоих из них спасти не удалось, а еще трое выздоровели, но неизвестно, какую роль в этом сыграла митохондриальная аутотрансплантация.
Можно представить себе, что комбинация этих двух методов могла бы породить полноценную терапию, в ходе которой донорские митохондрии вводили бы в кровь пациента, а они заселяли бы поврежденные митохондриальной болезнью ткани. Однако у научного сообщества остается немало вопросов к этим процедурам. Несмотря на то, что отдельные митохондрии действительно могут выжить в плазме крови, неизвестно, способны ли клетки тела их захватывать, а если да, то выживают ли они внутри. Защитники метода отмечают, что «иногда необходимо принять технологию, даже если мы не знаем, как она работает».
Есть и более радикальные решения митохондриальных проблем: так, еще несколько лет назад самый знаменитый борец со старением Обри ди Грей предложил перенести все гены из митохондрии в ядро. Два из них его коллегам удалось переместить и показать, что даже оттуда они успешно справлялись со своими обязанностями.
И хотя этот проект кажется еще менее реалистичным, чем все прочие, может оказаться, что некоторые митохондриальные гены можно пересаживать по отдельности — подобно тому как с мутациями в ядерной ДНК пытаются справиться с помощью генной терапии. Такие работы тоже есть, есть и первые клинические испытания — так пытаются лечить наследственную оптическую нейропатию. Хитрость здесь в том, что генная терапия доставляет митохондриальный ген не в митохондрию, а в ядро. Тем не менее, можно так сконструировать искусственный ген, чтобы получившийся продукт клетка транспортировала в митохондрию, и тогда неважно, где он производится.
Новая тропа
И все же гораздо надежнее было бы переписать мутантный митохондриальный ген раз и навсегда. Этой задачей занялся Дэвид Лю, один из главных специалистов в мире по редактированию генома. Именно он в 2016 году придумал, как исправлять мутации, не разрезая ДНК, — и собрал редактор оснований (base editor). Это молекулярная система из двух ферментов: dCas9, который наводится на конкретное место в ДНК, и дезаминазы, что исправляет один нуклеотид на другой, буквально переписывая «генетический текст» наживую.
Для митохондрий и этот метод не годится. Редакторы оснований напрямую зависят от направляющей РНК, которая доставляет их к цели: потом Cas расплетает спираль ДНК на две отдельные нити, с одной связывается РНК, а другую атакует дезаминаза. Но направляющая РНК не может проникнуть внутрь митохондрии — не хватает транспортной системы, которая бы протаскивала ее сквозь две мембраны . Нужно было придумать какую-то систему, которая работает без РНК. Недавно команда Лю создала такую систему. И работает она еще и без Cas.
Система построена на основе антибиотика DddA, который выделяет бактерия Burkholderia cenocepacia. У него есть две важные особенности: во-первых, он действует точечно: исправляет в целевом гене все С (цитозиновые нуклеотиды) на А (адениновые) — точнее, сначала, переводит С в U (урацил), а клетка превращает их в А — то есть работает дезаминазой. Во-вторых, в отличие от всех других редакторов оснований, он связывается с двухцепочечной ДНК — а значит, нет необходимости ее разделять на две нити с помощью направляющей РНК, которая не пролезает в митохондрии.
Но просто так без направляющей РНК все равно не обойтись — необходим какой-то другой механизм, чтобы нацелить DddA на нужное место в митохондриальном геноме. И здесь команда Лю сделала шаг назад и воспользовалась технологией, которая, казалось бы, давно уступила место CRISPR — TALEN. Это бактериальные ферменты-конструкторы: они построены из доменов, каждый из которых распознает определенную последовательность ДНК. Подбирая нужный комплект доменов, можно добиться того, чтобы фермент садился на конкретное место в геноме. Эта технология, которая давно считается более сложной и дорогой, теперь может закрыть ту нишу, которая CRISPR оказалась не по зубам.
Соединив подобранный TALEN с нетоксичной частью DddA (той, что способна только дезаминировать ДНК, а не распознавать ее участки), команда Лю получила заветный инструмент. Правда, для клинического применения он еще сыроват: в разных экспериментах он смог переписать не больше половины своих мишеней в клетках. Тем не менее, он проникает в митохондрии и не разрушает их изнутри, и это гораздо важнее, чем эффективность, которую несложно нарастить.
И если это удастся сделать, то мы сможем считать, что в организме человека больше нет такого гена, который мы не в силах изменить. Не останется ни единого участка ДНК, который будет нам неподвластен.
Инструмент Лю не требует никакого «третьего родителя», а его работа даже отдаленно не напоминает клонирование. А значит, шансы на то, чтобы оказаться не задевающим ничьи чувства и не вызывающим оправданные опасения, у него выше. Но каков будет следующий поворот этого сюжета? Вариантов два: долгие и тщательные испытания и постепенное применение нового редактора на взрослых людях (как происходит, например, с генной терапией) или авантюра с участием эмбрионов и попытки очередного первопроходца опередить свое время (так было с митохондриальной трансплантацией, так было с CRISPR и как, возможно, будет еще не раз). До клиники митохондриальному редактору еще далеко. Но делать ставки на то, какая судьба его ждет через несколько лет, можно уже сейчас: будет ли это очередной скандал, запрет и поиск новой дороги — или же в конце этой истории все-таки можно будет поставить, наконец, точку вместо вопросительного знака?
Автор статьи:Полина Лосева
Отличный комментарий!